ПЛР: надчутлива діагностика

Щоб допомогти вам зрозуміти, що воно таке і чим вирізняється серед інших типів лабораторних досліджень, я спробую розказати про нього простими словами. 

У літературі часто зустрічається образний опис ПЛР про те, що це метод, за допомогою якого вчені можуть знаходити голку в стозі сіна і потім будувати стіг із цих голок. Загалом дуже точний опис. Якщо продовжувати порівняння, то голка — це невелика ділянка генетичного матеріалу, а стіг сіна — організм людини, в якому цей мікроорганізм оселився. 

Метод ПЛР був розроблений у 1983 році Керрі Мюллісом, за що вчений був удостоєний Нобелівської премії. Спершу метод застосовували переважно для наукових цілей, але потім, роздивившись його перспективність та ефективність, почали просувати в практичну медицину. 

ПЛР дає можливість швидко і точно виявити будь-які ДНК і РНК, навіть коли безсилі інші методи. Його використовують у різних напрямах діагностики захворювань, таких як інфекційні, онкологічні та генетичні недуги. Більше того, окрім цього, його ще застосовують для ідентифікації особистості та діагностики патогенів у їжі. 

Однак головним напрямом ПЛР-діагностики є діагностика інфекційних захворювань. На відміну від імуноферментного аналізу (ІФА), що широко використовується в цій області, ПЛР-діагностика допомагає визначати безпосереднього збудника захворювання в дуже низькій концентрації. 

Принцип роботи методу полягає в багаторазовому копіюванні — науково це називається ампліфікація, — в пробірці певних ділянок ДНК у процесі повторюваних температурних циклів. При цьому використовуються спеціальні прилади — ампліфікатори. 

Як же все відбувається на практиці? Почнімо з самого початку. 

За генетичну інформацію в живому організмі будь-якого розміру відповідає ДНК — двоспіральна дезоксирибонуклеїнова кислота, що складається з послідовності чотирьох нуклеотидів, які заведено позначати буквами А — аденін, Г — гуанін, Т — тимідин і Ц — цитозин. Одне з основних правил генетики — правило комплементарності, тобто нуклеотиди сусідніх спіралей ДНК з'єднуються в певному порядку: А – з Т, Г – з Ц і ніяк інакше. 

У кожної живої істоти – бактерії, вірусу, риби, звіра чи людини — своя ДНК, причому для виявлення конкретного організму достатньо мати лише невелику ділянку цього сховища генетичної інформації. Деякі види мікроорганізмів, наприклад, вірус імунодефіциту людини, гепатиту С і навіть COVID-19, зберігають генетичну інформацію в іншій нуклеїновій кислоті — РНК. А от її фрагменти можна знаходити за допомогою методу ПЛР. 

Саме на виявленні цієї невеликої, але унікальної для кожного окремого організму ділянки і побудований принцип ПЛР. Для кожного збудника створений свій специфічний генетичний детектор, еталонний фрагмент ДНК. Він називається праймер. Та за принципом комплементарності він точно виявляє «свій» фрагмент ДНК і запускає реакцію створення величезної кількості його копій. 

Один цикл ПЛР триває близько трьох хвилин, кількість копій зростає в геометричній прогресії. Таким чином, за кілька годин кількість фрагментів збільшується в кілька мільярдів разів, тому визначити збудник конкретної інфекції досить легко. 

Який матеріал необхідний для дослідження? 

Оскільки найчастіше методом ПЛР користуються для діагностики саме захворювань, що передаються статевим шляхом, у цьому випадку матеріалом для дослідження є урогенітальний зішкріб. Однак також для аналізу ПЛР біоматеріалом може бути слина, мокротиння, зішкріб із носоглотки та ротоглотки, кров, спинномозкова рідина, сеча тощо. 

Оцінювати результати реакції повинен практичний лікар, який лікує конкретного хворого. 

Річ у тім, що не завжди позитивна відповідь тесту означає наявність захворювання. Наприклад, людина пройшла курс лікування від якогось захворювання, але загиблий і вже безпечний збудник ще деякий час залишатиметься в ДНК. Це називається «мертва ДНК». Якщо в цю мить зробити ПЛР-аналіз, результат виявиться позитивним. 

Інший варіант розвитку ситуації може бути такий: негативний результат ПЛР за наявності навіть явної клінічної картини конкретного захворювання. Одна з найбільш можливих причин — матеріал для дослідження був узятий «не звідти». Саме тому зразок повинен брати кваліфікований лікар, суворо дотримуючись інструкції, яку дає йому лабораторія. 

Принцип роботи методу зрозумілий. Але ж у чому його унікальність? 

Одна з найголовніших переваг цього типу дослідження — його універсальність. ПЛР дає змогу виявляти будь-які ДНК і РНК, навіть коли безсилі інші методи. 

Наступна перевага — висока специфічність. У матеріалі, надісланому на дослідження, визначається унікальна послідовність нуклеотидів, характерна тільки для конкретного збудника. Таким чином, можна говорити, що специфічність методу сягає 100%. Крім того, це дає можливість одночасно, в одному і тому ж матеріалі, здійснювати пошук кількох збудників без будь-якої шкоди для якості відповіді. 

До того ж метод характеризується високою чутливістю. А це дає змогу знайти лише один фрагмент генетичного матеріалу збудника та провести не лише якісну, але й кількісну оцінку вмісту нуклеїнових кислот. 

Ще одна безсумнівна перевага методу — оперативність. Постановка реакції займає кілька годин, таким чином уся діагностика, від моменту здачі матеріалу до отримання результату, займає всього один день. 

Важливо розуміти, що за допомогою ПЛР визначають збудника, а не реакцію на його наявність із боку організму. Таким чином, з'явилася можливість точно діагностувати захворювання ще в інкубаційному періоді, коли немає жодних клінічних або лабораторних ознак хвороби. 

Однак у будь-якому випадку не можна обмежуватися тільки одним методом... 

Найкраще комбінувати різні методи дослідження. Крім визначення самого збудника методом ПЛР, необхідно оцінювати імунну відповідь організму, що визначається традиційними серологічними методами, наприклад, ІФА-аналізом. 

І пам'ятайте, позитивний результат будь-якого, навіть найбільш сучасного лабораторного дослідження — це привід не для паніки, а для візиту до лікаря.